- 原文链接：Integrated Single-Cell Virtual Knockout and Machine Learning Analyses Reveal a Protective Role of CKAP2 in Gastric Cancer
- 发表时间：2026年6月
摘要
本研究整合TCGA、GEO、单细胞RNA测序、GWAS/pQTL以及临床实验数据，结合差异表达分析、WGCNA、机器学习、PPI网络、单细胞虚拟敲除、CellChat、GSEA、Cox回归、免疫浸润分析和双向孟德尔随机化等方法，系统揭示了CKAP2在胃癌中的作用。结果显示，CKAP2在胃癌组织和恶性上皮细胞中显著高表达，但其高表达与更好的总生存和无进展生存相关，并可作为独立保护因素。单细胞虚拟敲除和富集分析提示CKAP2可能通过调控5-HT相关通路影响胃癌进展；MR分析进一步支持CKAP2对胃癌的保护效应以及5-HT的促癌作用。免疫分析表明CKAP2与TMB、MSI-H及多种免疫细胞浸润相关。Western blot实验验证了CKAP2在胃癌细胞和组织中的高表达。总体而言，CKAP2可能是胃癌潜在的预后标志物和治疗靶点，CKAP2/5-HT轴值得进一步研究。
一、文章简介
本文主要目的是通过整合bulk转录组、单细胞RNA测序、机器学习、单细胞虚拟敲除（vKO）和孟德尔随机化（MR）等多种数据分析方法，系统识别胃癌（GC）中的关键基因，并阐明CKAP2在胃癌发生发展中的作用机制。
数据来源：
| Datasets Name | Data Type | Sample Number |
|---|---|---|
| TCGA-STAD | bulk RNA sequencing data | 412 GC tissues and 36 normal GC tissues. |
| Clinical TCGA-STAD | Clinical STAD data | 432 patients with STAD |
| GSE13911 | bulk RNA sequencing data | 38 GC specimens and 31 controls. |
| GSE65801 | bulk RNA sequencing data | 32 GC samples and 32 normal tissues |
| GSE13861 | bulk RNA sequencing data | 65 GC samples and 19 normal tissues |
| GSE29272 | bulk RNA sequencing data | 62 GC samples and 134 normal tissues |
| GSE163558 | single-cell RNA data | 3 tumor tissues and 1 normal tissue. |
| GSE184198 | single-cell RNA data | 1 tumor tissues and 1 normal tissue. |
| GWAS-GC | GWAS statistics data | GWAS on GC in 16,380,305 nsnp |
| GWAS-CKAP2 | pQTL statistics data | GWAS on CKAP2 in 10,534,735 nsnp |
| GWAS-5-HT | pQTL statistics data | GWAS on 5-HT in 2,545,835 nsnp |
主要分析方法：
差异表达分析、WGCNA、机器学习建模、PPI网络、单细胞聚类注释、inferCNV、scTenifoldKnk虚拟敲除、CellChat、GSEA、Kaplan–Meier、生存Cox回归、免疫浸润分析、Mendelian Randomization、Western blot。
二、主要结论
1. 差异表达分析 + WGCNA筛出胃癌相关候选基因，20个基因进入后续机器学习筛选
研究先在TCGA和两个GEO数据集中做差异分析，得到大量胃癌相关DEGs；随后利用WGCNA构建共表达网络，从模块中筛出与肿瘤表型相关性最强的基因集合。
2. 机器学习模型比较显示RF + LDA表现最佳，最终锁定CKAP2等8个关键特征基因
研究构建了12种算法、113个机器学习模型（Fig3A-B），并在多个外部队列中验证稳定性（Fig3C-G）。 寻找综合表现最好的算法（RF + LDA，AUC 0.959），在训练集和多个外部验证集中也保持较高识别能力，说明模型具有较强泛化性。最终筛选出8个核心特征基因（RFC3、PAICS、CENPF、AKR1B10、KPNA2、RNASE1、CKAP2、DTL）。进一步通过PPI网络和节点中心性分析，锁定5个hub基因(Fig3H-I,tab1)，其中CKAP2成为后续重点研究对象。
tab1：Network topology parameters of the eight crucial genes.
| No | Crucial Gene | Degree | MCC | MNC | EPC |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | CENPF | 3 | 3 | 1 | 2.953 |
| 2 | DTL | 2 | 2 | 1 | 2.723 |
| 3 | KPNA2 | 2 | 2 | 1 | 2.709 |
| 4 | RFC3 | 2 | 2 | 1 | 2.69 |
| 5 | CKAP2 | 1 | 1 | 1 | 2.141 |
| 6 | PAICS | / | / | / | / |
| 7 | AKR1B10 | / | / | / | / |
| 8 | RNASE1 | / | / | / | / |
3. 单细胞分析发现CKAP2主要在恶性上皮细胞中高表达，提示其来源于肿瘤细胞本身
对单细胞进行聚类注释，识别出8种主要细胞类型（Fig4A-B）。肿瘤组中上皮细胞比例显著高于正常组。差异分析显示CKAP2在肿瘤组织中显著高表达（Fig D–F）。聚焦上皮细胞进行GO/KEGG富集，发现DEGs显著富集于消化系统功能和雌激素信号通路。
Fig 4：
4. 单细胞虚拟敲除提示CKAP2可能通过5-HT分泌/血清素相关通路影响胃癌
对上皮细胞亚群进行inferCNV分析，以T细胞为二倍体参考，识别出Epi_0、Epi_1、Epi_4、Epi_11为恶性上皮细胞（Fig5B–D）。CKAP2在恶性上皮中表达显著升高（Fig5E–F）。
进一步利用scTenifoldKnk进行CKAP2虚拟敲除，比较扰动前后的基因调控网络，鉴定出差分调控基因（Fig5G-J）。富集分析显示这些基因显著富集于5-HT分泌相关通路（Fig5K），从单细胞层面将CKAP2与5-HT信号建立功能联系
这一步把CKAP2从“一个预后基因”进一步推进为“一个可能连接肿瘤细胞与神经递质信号的调控节点”，为后续MR验证提供了方向。
Fig 5：
5. CellChat显示肿瘤微环境中细胞通讯增强，APP-CD74轴可能参与肿瘤进展
CellChat分析比较正常与肿瘤组织中的细胞通讯模式，肿瘤组织中细胞通讯数量和强度均显著高于正常组织（Fig6A）。其中上皮细胞与组织干细胞在增强的通讯网络中占据核心地位（Fig6F–G）。配体-受体分析显示APP-CD74信号轴在肿瘤组中交互概率显著增强（Fig6L），提示恶性上皮细胞可能通过该轴促进GC进展。
6. GSEA + 生存分析表明CKAP2与细胞周期/ DNA复制相关，但高表达反而对应更好预后
GSEA分析显示CKAP2高表达富集于"姐妹染色单体分离"、“DNA复制”、“细胞周期"等通路（Figure 7A–B）。生存分析表明高表达组OS（p=0.024）和PFS（p=0.0065）均显著更优（Figure 7D–E）。多因素Cox回归显示CKAP2为独立保护因子（HR=0.679, 95%CI: 0.523-0.880, p=0.003）（Figure 7G），即CKAP2每升高一个单位，死亡风险降低约32%。
这是文章最重要的“反直觉结论”：一个看起来与增殖相关、且在肿瘤中高表达的基因，居然与更好预后相关。
7. 临床分层分析 + 列线图说明CKAP2具有一定的临床预测价值
临床分层结果显示，CKAP2与年龄、组织学分级存在显著关联，但与性别、TNM等指标关系不明显（Fig8F，G）。CKAP2表达在>65岁患者中显著升高，在G3分级中显著高于G1（Fig8A,C）。将CKAP2与独立临床变量整合构建预后列线图（Fig 8H），校准曲线显示1、3、5年OS预测与实际观测一致性良好（Fig8I），说明该模型具有良好的临床预测价值。
8. 免疫浸润与TMB/MSI分析提示CKAP2可能关联更活跃的免疫状态
CKAP2与TMB呈显著正相关（R=0.46, p<2.2×10⁻¹⁶）（Figure 9A），在MSI-H亚型中占比更高（27% vs 11%, p=8.9×10⁻⁷）（Figure 9F）。免疫浸润分析显示CKAP2与M0巨噬细胞、静息NK细胞、CD4记忆活化T细胞等多种免疫细胞显著相关（Figure 9E），提示其可能参与塑造抗肿瘤免疫微环境。
免疫分析发现，CKAP2与TMB显著正相关（Fig9A），并且与多种免疫细胞存在相关性，如M0巨噬细胞、静息NK细胞、活化CD4记忆T细胞、滤泡辅助T细胞、单核细胞等（Fig9C-E）。 同时，CKAP2高表达更常见于MSI-H亚型（Fig9F）。
从数据分析角度，这可以说明CKAP2可能与更高的免疫原性和不同的肿瘤免疫微环境有关，从而解释其“高表达但预后更好”的现象。
9. 双向MR证明CKAP2对胃癌具有潜在保护效应，5-HT可能增加胃癌风险
tab 2：CKAP2 and its association with 5-HT in the MR analyses.
| Exposure | Outcome | No. of SNPs | Methods | OR (95% CI) | β (SE) | p |
|---|---|---|---|---|---|---|
| The forward MR analysis | ||||||
| CKAP2 | GC | 9 | IVW | 0.793 (0.636–0.990) | −0.231 (0.113) | 0.040 |
| 5-HT | GC | 10 | IVW | 5.371 (1.077–26.792) | 1.681 (0.820) | 0.040 |
| The reverse MR analysis | ||||||
| GC | CKAP2 | 9 | IVW | 1.013 (0.926–1.109) | 0.013 (0.046) | 0.776 |
| GC | 5-HT | 4 | IVW | 0.999 (0.980–1.018) | −0.001 (0.010) | 0.937 |
前向MR：
- CKAP2 → GC：OR=0.793（95%CI: 0.636-0.990），p=0.040，CKAP2升高与GC风险降低因果相关（保护因素）
- 5-HT → GC：OR=5.371（95%CI: 1.077-26.792），p=0.040，5-HT升高与GC风险增加因果相关（危险因素） 反向MR：
- GC → CKAP2和GC → 5-HT：均不显著（p=0.776、p=0.937）
10. Western blot实验验证CKAP2在胃癌细胞和组织中确实高表达
在GC细胞系（HGC-27、MKN-45）中CKAP2蛋白表达显著高于正常胃上皮细胞GES-1（Fig10A）；在配对临床组织中，肿瘤组织的CKAP2蛋白水平也显著高于癌旁正常组织（Fig10B），从蛋白层面验证了转录组发现。完成了从多组学发现 → 统计验证 → 实验验证的闭环。
三、文章小结
这是一套非常适合用于肿瘤关键基因筛选与机制挖掘的流程，整合了差异表达分析、WGCNA共表达网络构建、多机器学习算法组合建模、PPI网络分析、单细胞转录组定位、虚拟敲除、生存预后与临床关联评估、免疫微环境与MSI/TMB分析、孟德尔随机化验证以及实验验证等多个模块，形成了一条逻辑严密、层层递进的干湿结合研究范式。
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数据维度全面：涵盖bulk转录组 → 单细胞转录组 → GWAS遗传数据 → 实验验证，从宏观到微观，从人群到分子，层层递进。
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方法学前沿且多元：从经典的DEGs/WGCNA，到热门的机器学习（113种模型组合），再到最新的单细胞虚拟敲除（scTenifoldKnk）和孟德尔随机化，几乎囊括了当前生信领域所有主流及前沿工具。
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逻辑链条严密：从“相关性（表达差异）→ 网络定位（WGCNA/PPI/scRNA）→ 机制推断（vKO）→ 临床价值（预后/免疫）→ 因果关系（MR）→ 实验证实（WB）”，形成了一个完整的证据闭环。
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临床转化潜力清晰：不仅有生物标志物价值（预后列线图），还提出了潜在的治疗靶点（CKAP2/5-HT轴），且MR分析为靶点干预提供了遗传学支持。
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干湿结合：纯生信筛选 + 机制推断 + 实验验证，完美契合当前高分期刊（如Molecules、Frontiers系列、Journal of Translational Medicine等）的审稿偏好。
“差异分析 → WGCNA → 机器学习筛选 → PPI锁定hub → 单细胞定位 → 虚拟敲除机制推断 → 生存/临床关联 → 免疫分析 → MR因果验证 → 实验验证”，这套流程本质上是从“海量公共数据”中“层层过滤”关键靶点，并在“单细胞精度”和“遗传因果层面”深入解析机制，最后用“湿实验”点睛，本文综合了现阶段常用的生信分析方法，是现阶段一个很好的发文套路。